【正海新知】PCR實(shí)驗室為什么要進(jìn)行三區隔離？

PCR實(shí)驗室總是出現假陽(yáng)性，明明沒(méi)有加模板，最后卻擴出了產(chǎn)物。如果這種現象頻頻出現，就要注意一下操作環(huán)境了。

PCR反應過(guò)程中不斷進(jìn)行升溫降溫，液體蒸發(fā)又冷凝，PCR管中部分空氣形成氣溶膠，攜帶大量的DNA擴增產(chǎn)物（注意，1ng擴增產(chǎn)物中可作為模板的DNA片段數量，超過(guò)1ng起始模板中可擴增DNA片段數量的幾百萬(wàn)倍甚至更高。比如人的基因組DNA有30億個(gè)bp，要擴增的單拷貝基因片段是300bp，1ng起始模板中可以作為模板DNA片段只占總起始模板DNA總量的千萬(wàn)分之一）。如果在實(shí)驗室打開(kāi)含PCR擴增產(chǎn)物的管蓋，大量攜帶DNA擴增產(chǎn)物的氣溶膠就會(huì )涌出，擴散到空氣中，從而對環(huán)境造成污染。

雖然在整個(gè)空間環(huán)境中DNA的含量很低，但由于理論上只要有1個(gè)可做為模板的DNA片段也能PCR擴增成功，這就是為什么在污染環(huán)境中陰性對照也能擴增出條帶的原因。

所以在專(zhuān)業(yè)的PCR實(shí)驗室（比如臨床PCR檢驗實(shí)驗室），通常有四區隔離（或至少是三區隔離）的要求。

常見(jiàn)的三區是指：

1、試劑配制區：PCR反應體系的配制區域。 

2、標本處理區：包括擴增模板的制備，即提取DNA的地方。

3、PCR擴增和產(chǎn)物分析區：進(jìn)行PCR擴增的區域，也是擴增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析的區域。 

如果將PCR擴增區域和產(chǎn)物分析區再次分開(kāi)，就是四區隔離。四區隔離，主要目的是防止氣溶膠在各個(gè)PCR區域之間的流動(dòng)，最好的方法是每個(gè)區域隔一幢樓，但操作起來(lái)不現實(shí)，于是便有了針對不同區域設置正負壓的方法： 

試劑配制區（Ⅰ區）：最潔凈的區域，保持微正壓使得外界空氣無(wú)法進(jìn)入隔離污染源。并且陰性模板應該在此區加入PCR管并蓋蓋，嚴禁在此區域打開(kāi)、存放裝有DNA模板的離心管。

DNA模板添加區（Ⅱ區）：壓力比Ⅰ區低，保證內部空氣不外泄，以免陽(yáng)性模板的氣溶膠對外界環(huán)境造成污染。

擴增及PCR產(chǎn)物分析區（Ⅲ區）：保持負壓，使得內部空氣不外泄，以免擴增產(chǎn)物的氣溶膠對外界環(huán)境造成污染。

操作時(shí)壓力遵循Ⅰ區→Ⅱ區→Ⅲ區單一方向進(jìn)行，不可逆向進(jìn)行。

既然PCR三區隔離的目的是為了阻斷氣溶膠的交流，請注意以下細節，思考一下氣溶膠來(lái)自哪里：

 1. 每個(gè)區域都應配備專(zhuān)用的移液器，不可交叉混用。我們的一位用戶(hù)拿電泳室的移液器加模板，陰性對照擴出了很亮的條帶。 

2. 每個(gè)區域都應配備專(zhuān)用的移液器吸頭，不可交叉混用。 

3. 如果條件允許，在PCRⅢ區工作結束后再次進(jìn)入PCR I區需要更換實(shí)驗服、一次性鞋套、帽子、手套。 

4. 在PCR I區、PCRⅡ區配備帶濾芯吸頭。